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熒光定量PCR和數(shù)字PCR的區(qū)別

來源: 上海美析儀器有限公司    2023年10月20日 09:53  

定量PCR還是數(shù)字PCR

隨著數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用的展開,越來越多實(shí)驗(yàn)室被其絕對(duì)定量的方式、結(jié)果的高靈敏度、高重復(fù)性等特質(zhì)所吸引。2012年年底,由Frost & Sullivan公司在北美市場進(jìn)行的調(diào)研顯示,約三分之一的被訪者表示會(huì)考慮購買數(shù)字PCR設(shè)備。

那么,是否意味著目前在研究、臨床和工業(yè)領(lǐng)域內(nèi),廣泛采用的熒光定量PCR技術(shù)將被淘汰?數(shù)字PCR很快就要將其徹di取代?越來越多實(shí)驗(yàn)室對(duì)陳斯卡提出類似問題。結(jié)合多年推廣定量PCR與近幾年投身數(shù)字PCR領(lǐng)域的經(jīng)驗(yàn)心得,陳斯卡談?wù)勛约旱捏w會(huì),供大家參考。

陳斯卡總體的觀點(diǎn)是:雖然絕大多數(shù)定量PCR的應(yīng)用都可以使用數(shù)字PCR完成,但在可預(yù)期的將來,兩者將長期共存。到底使用定量PCR還是數(shù)字PCR,取決于具體應(yīng)用和對(duì)數(shù)據(jù)的要求。兩者不是either/or的關(guān)系,而是both/and的關(guān)系。兩種技術(shù)平臺(tái)各自的特點(diǎn)與現(xiàn)狀大致可從下面8個(gè)方面說明。

1.   20多年的使用和發(fā)展中,定量PCR作為一種技術(shù)平臺(tái),已經(jīng)產(chǎn)出海量的數(shù)據(jù),在工業(yè)界和分子檢測的某些應(yīng)用上,定量PCR已經(jīng)成為“金標(biāo)準(zhǔn)”。基礎(chǔ)研究方面,則形成了被稱為MIQE的“定量PCR標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)指南”。

2.   在定量PCR的各種應(yīng)用中,基因表達(dá)分析(gene expression analysis)的應(yīng)用比重約占七成,綜合各種因素來看,眼下定量PCR還是進(jìn)行基因表達(dá)研究的理想手段。

3.   上述的“各種因素”具體展開,主要包括:通量、自動(dòng)化程度、各種檢測探針與染料、檢測通道、成本和可參考文獻(xiàn)與protocol的數(shù)目等等。

4.   就目前市場上已有的數(shù)字PCR設(shè)備來看,定量PCR在檢測的線性范圍上具有優(yōu)勢,意味著同一個(gè)run內(nèi)可對(duì)各種表達(dá)豐度的樣品進(jìn)行分析。

5.   目前定量PCR已經(jīng)能實(shí)現(xiàn)高通量樣品條件下的自動(dòng)化操作。

6.   數(shù)字PCR在單分子層面上的絕對(duì)定量,可以徹di擺脫對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的依賴而直接給出靶序列的拷貝數(shù),提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果在批內(nèi)和批間的穩(wěn)定性,甚至能用來對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)。

7.   基于絕對(duì)定量的方式,數(shù)字PCR結(jié)果的高重復(fù)性和高精度可實(shí)現(xiàn)微小差異的基因表達(dá)分析,如等位基因的不平衡表達(dá)、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、microRNA表達(dá)分析等等。所謂“微小差異”的標(biāo)準(zhǔn)一般而言是指表達(dá)水平的差異在2倍以內(nèi)。

8.   同等條件下,數(shù)字PCR在靈敏度方面擁有優(yōu)勢,使得該技術(shù)已成為腫瘤的液態(tài)活檢、病原微生物檢測、轉(zhuǎn)基因成分測定、宿主殘留DNA分析等的熱門技術(shù)。


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