殺稻瘟菌素 S（Blasticidin S) 常用試劑
殺稻瘟菌素 S（Blasticidin S) 常用試劑
產(chǎn)品濃度：10mg/ml
Selection antibiotic: cell culture tested, sterile reagent
作用機理：
Blasticidin S是一種來自Streptomyces griseochromogenes的核苷類抗生素，通過干擾核糖體中肽鍵的形成來特異性地抑制原核和真核生物的蛋白質(zhì)合成。Blasticidin S用于篩選攜帶有bsr或BSD耐受基因的轉(zhuǎn)染細胞。殺稻瘟菌素具有快速而強效的作用模式，很低的抗生素濃度便能導(dǎo)致細胞迅速死亡。
抗性基因：
目前已經(jīng)克隆和測序的殺稻瘟菌素耐受基因有3種，一種是分離自產(chǎn)生菌Streptoverticillum sp.的乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因bls，另外兩種是脫氨酶基因，包括從Bacillus cereus 中分離的bsr和從Aspergillus terreus 中分離的BSD 基因。Bsr和 BSD基因是常用的篩選標志，用于哺乳動物和植物細胞的基因轉(zhuǎn)移實驗，也可用于E.Coli。
運輸與保存方法
冰袋（wet ice）運輸。收到產(chǎn)品后放到-20 oC保存，有效期至少1年，避免反復(fù)凍融。
應(yīng)用濃度：
1）Escherichia coli
E. coli對Blasticidin S的敏感性稍差，但是轉(zhuǎn)化子對Blasticidin S具有耐受性，可以用低鹽LB培養(yǎng)基（pH 8）進行篩選，濃度范圍為50-100 μg/ml Blasticidin S。高pH值可以提高Blasticidin S的活性。
2）哺乳動物細胞
哺乳動物細胞中Blasticidin S的工作濃度范圍在1-50 μg/ml。初次實驗建議通過滅殺曲線來確定最佳使用濃度。
- 25-100 µg/ml in bacteria
- 1-30 µg/ml in mammalian cells
操作步驟（哺乳動物穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選）：
Blasticidin S通常使用濃度為10 μg/ml。攜帶bsr或BSD基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中，在含有Blasticidin S的正常生長培養(yǎng)基中孵育，用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。
（1）轉(zhuǎn)染后48h，用含有適宜濃度Blasticidin S的新鮮培養(yǎng)基將細胞傳代（注：細胞處于活躍分裂期時抗生素工作最好。細胞密度太高，抗生素效率降低。細胞分盤時覆蓋率最好不超過25%）；
（2）每3-4天去除培養(yǎng)基，加入含抗生素的新鮮培養(yǎng)基；
（3）7天后檢測細胞集落形成。根據(jù)宿主細胞種類和轉(zhuǎn)染/篩選效率，集落形成可能需要增加一周或更久。
（4）轉(zhuǎn)移5-10個耐受克隆到35mm細胞盤中，加入選擇培養(yǎng)基維持培養(yǎng)7天。隨后用細胞毒性實驗進行檢測。
