羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽 常用溶液
羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽 常用溶液
鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來(lái)源于毒蕈類(lèi)鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結(jié)合于絲狀肌動(dòng)蛋白F-actin，而不會(huì)與單體肌動(dòng)蛋白G-actin結(jié)合，通常用來(lái)標(biāo)記組織切片，細(xì)胞培養(yǎng)物或無(wú)細(xì)胞體系中的F-actin，從而對(duì)F-actin進(jìn)行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維，無(wú)論是動(dòng)植物來(lái)源的肌肉細(xì)胞或非肌肉細(xì)胞，按照每一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基約與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的計(jì)量比結(jié)合。且非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識(shí)度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動(dòng)蛋白（Actin）抗體進(jìn)行相關(guān)研究。另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約12-15?，分子量＜2000 Daltons，未標(biāo)記肌動(dòng)蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發(fā)生反應(yīng)；鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標(biāo)記后仍可收縮等。
鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動(dòng)蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動(dòng)態(tài)平衡。此特性使得肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。
本品為T(mén)RITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，染色反應(yīng)特異性強(qiáng)，對(duì)比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測(cè)。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性。且本品的結(jié)合沒(méi)有物種差異性，適用性廣泛。
1. 工作液準(zhǔn)備
本品以溶于甲醇的 20µM 儲(chǔ)存液形式提供，總量為 300µl。按照 100 nM 的工作液濃度來(lái)?yè)Q算，可制備總量為 60 ml 的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對(duì)母液進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。開(kāi)始實(shí) 驗(yàn)前，使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
2. 染色步驟
1） 細(xì)胞爬片生長(zhǎng) 24h，使其密度達(dá)到 50%匯合度。
2） 吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的 1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞 2 次。
3） 使用溶于 PBS 的 4%甲丨醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定 10min。 注意：避免固定劑中含有甲醇成分，因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^(guò)程中可能破壞肌動(dòng)蛋白。
4） 室溫條件下，用 PBS 清洗細(xì)胞 2~3 次，每次 10min。
5） 室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化處理 5min。
6） 室溫條件下，用 PBS 清洗細(xì)胞 2~3 次，每次 10min。
7） 取 200µl 配制好的 TRITC 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育 30min（通常情況下， 4℃~37℃孵育皆可）。 注意：為了降低背景，可于 TRITC 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入 1% BSA；另外，孵育過(guò)程中為了避免溶液揮 發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封的容器內(nèi)。
8） 用 PBS 清洗蓋玻片 3 次，每次 5min。
9） 使用 200µl DAPI 溶液（濃度：100 nM）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約 30s。
10) 用 PBS 清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫 掉多余封片劑，然后用指甲油封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于 4℃避光保存，通常 6 個(gè)月內(nèi)可繼續(xù)做 F-actin 染色分析。 注意：也可以直接使用含有 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑合并步驟 9）10），簡(jiǎn)化步驟。
11) 熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀(guān)察，選擇 TRITC 激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=540/570nm）和 DAPI 激 發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。
